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Anticorps catalytiques et répertoires immuns murins

analyse génétique, biochimique et bio-informatique

Type de document : Thèse
Langue : français

Responsabilité(s) :


Numéro national de thèse : 2019COMP2495

Année de publication : 2019


Discipline : Biotechnologie : Unité de recherche Génie Enzymatique et Cellulaire - GEC (UMR-7025)

Sujets :


Mots clés :

Résumé(s) :

  • A la fin des années 80, des anticorps catalytiques ont été découverts dans le sérum de patients, en particulier de patients atteints de maladies auto-immunes. Certains anticorps catalytiques ont un effet bénéfique sur la santé, tandis que d'autres sont délétères. Afin de comprendre le lien existant entre anticorps catalytiques et pathologies auto-immunes, des travaux antérieurs ont mené à la synthèse de quatre banques de fragments d anticorps (scFv) exposés en surface de phages, représentant différents fonds génétiques et états immunologiques. Les scFv, constitues des régions variables des chaines lourdes (H) et légères (L) des anticorps, sont codes par différents segments de gènes d'immunoglobuline : V-D- J pour la chaine lourde, V et J pour la chaine légère. Dans l'objectif de récolter des informations sur l immunogénétique des anticorps catalytiques, la distribution des sous-groupes de gènes au sein de chaque répertoire a été étudiée, en se basant sur l étude de plus de 300 000 séquences. L'analyse des données NGS a montré une expression différentielle des sous-groupes de gènes selon la banque d origine, suggérant que le fond génétique et / ou l'état immunologique influencent l'expression du sous-groupe de gènes d'immunoglobuline. La présence d'anticorps potentiellement catalytiques à activité b-lactamase a ensuite été étudiée dans les quatre banques par une approche in silico de modélisation tridimensionnelle. Les résultats suggèrent que certaines banques expriment potentiellement plus d'anticorps catalytiques que d'autres. Enfin, dans le but de valider cette approche in silico, une approche in vitro a été initiée. Cinq scFv exposés à la surface des phages ont été sélectionnés lors d'un travail précèdent par un processus itératif sur la base de leur activité catalytique. Chacun possède une structure primaire et tertiaire unique. L un d entre eux, le scFv P90C2, a été cloné et exprimé dans des bactéries E. coli BL21 (DE3) sous forme de corps d'inclusion, puis solubilise et enfin renaturé. Bien que le scFv P90C2 soluble conserve son activité de reconnaissance, son pouvoir catalytique est complètement perdu. L influence de différents paramètres sur la fonctionnalité du scFv a été évaluée : (i) optimisation des conditions du protocole de renaturation, (ii) choix des codons à l origine de la séquence peptidique du scFv, et enfin (iii) influence de la protéine de fusion pIII.
  • In the late 80s, catalytic antibodies have been discovered in the serum of patients, especially patients with auto-immune diseases. Some of the catalytic antibodies appear to have a beneficial effect on health while others are deleterious. In order to understand the link between catalytic antibodies and immune system pathologies, previous work leaded to 4 single chain Fragment variable (scFv) libraries exposed on phage surface, representing different genetic backgrounds and immunological states. The scFvs, composed with the variable regions of the heavy (H) and light (L) chains, are encoded by immunoglobulin gene subgroups V(H), D(H), J(H), V(L) and J(L). With the objective to decipher the potential origin of catalytic antibodies, a statistical representation of each subgroup within each repertoire has been done, based on more than 300 000 sequences. The NGS data analysis showed a variable expression of some gene subgroups (comprising rare ones) between the 4 libraries showing that the genetic background and/or the immunological state influence immunoglobulin gene subgroup expression. Then, we investigated the presence of antibodies with potent active sites in the libraries by molecular modelling. Libraries express more putative catalytic antibodies than others depending on the genetic background and the immunological state profile. Finally, in the objective to validate this in silico approach, an in vitro approach was considered. 5 scFvs exposed on phage surface have thus been selected during a previous work by iterative process on the basis of their catalytic activity: b-lactamase like activity. Each of them displays a unique primary and tertiary structure. The scFvs exposed on the phage surface must be catalytically active while expressed in soluble form too. One of the selected scFvs, P90C2, was optimized and expressed in E. coli BL21 (DE3) bacteria in the form of inclusion bodies and then solubilized and refolded. Although soluble P90C2 fully retained its binding activity, its catalytic potency was completely lost. Further experiments aimed to i) optimize refolding protocol, ii) study the impact of scFv codon-optimization, and iii) show the influence of the pIII fusion protein on the scFv catalytic activity.

Autre(s) titre(s):

  • Titre traduit : Catalytic antibodies and murine immune libraries : genetic, biochemical and bio-informatic approaches


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